1、宏蛋白質(zhì)組學(xué)研究溯源

“宏蛋白質(zhì)組學(xué)”這個術(shù)語來源于“宏基因組”（metagenome），是由Francisco Rodríguez-Valera提出的，用來描述在環(huán)境樣本中表達最多的基因和/或蛋白質(zhì)[1]。Wilmes和Bond提出了“宏蛋白質(zhì)組學(xué)”這一術(shù)語，用于在特定時間點對環(huán)境微生物群全部蛋白質(zhì)進行大規(guī)模表征[2]，與此同時，術(shù)語“微生物群落蛋白質(zhì)組學(xué)”和“微生物群落蛋白質(zhì)基因組學(xué)”有時被用于不同類型的實驗和結(jié)果。通過高分辨率“宏組學(xué)”的應(yīng)用，能夠解開體內(nèi)和周圍的“微生物暗物質(zhì)”。高通量“宏組學(xué)”方法在微生物生態(tài)學(xué)中得到了廣泛的應(yīng)用，因為它們允許對自然菌群的有機體和功能的原位組成進行前所未有的深入了解。通過連接遺傳潛能和最終表型，宏蛋白質(zhì)組學(xué)(通常也稱為群落蛋白質(zhì)基因組學(xué)1)提供了解決驅(qū)動微生物生態(tài)系統(tǒng)功能的主要功能組件的能力。在過去的十年里，通過宏蛋白質(zhì)組學(xué)在不同微生物菌群中的應(yīng)用，我們了解了它們在不同環(huán)境中發(fā)生的關(guān)鍵功能性狀。分析能力的初步進展非常迅速。雖然在2004年通過LC - MS/MS的de novo肽測序從2D-PAGE中僅能分離出3個蛋白質(zhì)[3],一年后，這個數(shù)字已經(jīng)被吉爾·班菲爾德(Jill Banfield)和同事通過鳥槍LC‐MS/MS方法從一個微生物群落中識別出2000多個蛋白質(zhì)，并通過對特定宏基因組數(shù)據(jù)庫進行搜索得到的數(shù)據(jù)。以下將討論一些具有代表性的宏蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用情景，其中包括活性污泥、酸性礦井排水生物膜、淡水和海水微生物群落、土壤、人體腸道微生物群、傳統(tǒng)發(fā)酵飲食的幾個代表性的宏蛋白質(zhì)組學(xué)研究。通過這些案例研究，強調(diào)了宏蛋白質(zhì)組學(xué)目前面臨的挑戰(zhàn)和可能的解決方案，以充分發(fā)揮其潛力，即在微生物群落組成、生理、功能、相互作用、生態(tài)和原位進化之間建立決定性的聯(lián)系。

2、宏蛋白質(zhì)組學(xué)文獻

2.1.1 宏蛋白質(zhì)組學(xué)文獻簡介

進入PubMed官網(wǎng)，以metaproteomics為關(guān)鍵詞搜索，可以看到宏蛋白質(zhì)組學(xué)研究近年增長迅速，僅2019年就有126篇文章發(fā)表。其中J Proteome Res.,Microbiome,Front Microbiol.,J Proteomics, Microorganisms這些雜志發(fā)表宏蛋白質(zhì)組學(xué)文章最多。從詞云圖可以看出，宏蛋白質(zhì)組研究范圍很廣，涉及從個體到環(huán)境、從陸地到水體等多個領(lǐng)域。

圖1.PubMed宏蛋白質(zhì)學(xué)發(fā)表文章數(shù)目統(tǒng)計

圖2. 宏蛋白質(zhì)組學(xué)文章發(fā)表雜志統(tǒng)計

圖3. 宏蛋白質(zhì)組文獻關(guān)鍵詞云

宏蛋白質(zhì)學(xué)中文文獻同樣增長迅速，研究領(lǐng)域遍及胃腸道、口腔、酒曲、土壤、底泥、海洋等方面。

3、宏蛋白質(zhì)組學(xué)研究案例

3.1 胃腸道

胃腸道微生物群可以說是研究得最好的宿主相關(guān)微生物群。胃腸道微生物群的研究主要是使用糞便樣本，因為糞便樣本容易獲取的、且具有非侵入性。然而，宏蛋白質(zhì)組學(xué)方法也被用于研究不同腸道部位的微生物黏膜-腔體界面[4]，并應(yīng)用于炎癥性腸病的隊列研究[5]，盡管宏蛋白質(zhì)組學(xué)的分辨率有限，還是顯示了炎癥和健康粘膜之間的強烈差異。
Verberkmoes等人在2008年對人類糞便微生物群進行了第一次深入的宏蛋白質(zhì)組學(xué)研究[6]，該研究能夠使每個樣本鑒定多達1340個非冗余蛋白質(zhì)。這項研究還證實了糞便宏蛋白質(zhì)組學(xué)受到宿主蛋白的廣泛影響，30%的檢測圖譜與人類蛋白數(shù)據(jù)庫相匹配。因此，在檢測前去除宿主細胞可以顯著增加微生物蛋白質(zhì)組的覆蓋深度[7]。然而，這些人類蛋白質(zhì)組的檢測也可以提供很多信息。對克羅恩病患者和健康人的糞便樣本的宏蛋白質(zhì)組的比較，反映了之前的宏基因組研究結(jié)果，其中包括克羅恩病患者的糞便微生物群功能豐富度降低[8]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，在克羅恩病患者和健康人之間，涉及腸上皮屏障功能的人類蛋白存在顯著差異。
對宏基因組和宏蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的比較表明，不同類群的豐度和同一生物類群中已鑒定的蛋白質(zhì)豐度是一致的，只有少數(shù)明顯的例外，如高活性但低豐度的雙歧桿菌[9]。同樣的研究描述了一個核心宏蛋白質(zhì)組的時間穩(wěn)定性，類似于以前的宏基因組觀察。然而，在抗生素治療效果的多組學(xué)時間序列研究中觀察到這種穩(wěn)定狀態(tài)的擾動[10]。這些研究表明，宏蛋白質(zhì)組學(xué)有能力解決腸道相關(guān)菌群的臨床相關(guān)活動，這些菌群與其他環(huán)境中的標志性蛋白(表1)可能在未來幾年被開發(fā)為生物標志物。

3.2 土壤

土壤是最具挑戰(zhàn)性的微生物生態(tài)系統(tǒng)之一[11, 12]，尤其對宏蛋白質(zhì)組學(xué)研究來說。這由于下述幾個原因：土壤成分對分析的干擾(如腐殖酸)、季節(jié)變化、空間復(fù)雜性和筑巢性，以及包括無脊椎動物和植物在內(nèi)的不同大型生物的存在。土壤異質(zhì)性導(dǎo)致了高度的多樣性，盡管后者一直備受爭議[13]，自從Gans等人[14]發(fā)表了每克土壤8x10⁶個不同分類單元的估計以來，最近的估計數(shù)字約為50000 [15]。盡管如此，鑒于蛋白質(zhì)的多樣性和總體復(fù)雜性，最近的研究強調(diào)了專門的蛋白質(zhì)提取方法的必要性，其中蛋白質(zhì)產(chǎn)量和可測量的蛋白質(zhì)組多樣性可以顯著增加[16, 17]。
盡管存在上述困難，但土壤顆粒和森林土壤水是使用宏蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究的首批環(huán)境樣本[18]。在后一項研究中，不同類群對蛋白質(zhì)組貢獻的差異與季節(jié)變化以及植被覆蓋對森林地下水蛋白質(zhì)組的狀態(tài)和性質(zhì)有關(guān)。此外，還鑒定了幾種參與分解土壤顆粒中植物物質(zhì)的酶類。凋落物的降解也是最近一項宏蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重點，該研究為凋落物分解過程中的演替提供了更深刻的見解，并使用先進的生物信息分析來解析提供最活躍的凋落物分解酶的分類群落[19]。
除植物物質(zhì)的分解外，土壤微生物也與活的植物根系密切相關(guān)，從而大大提高了它們的生產(chǎn)力。植物與微生物的相互作用一直是宏蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主題。尤其值得一提的是，Bao等人最近結(jié)合了宏蛋白質(zhì)組學(xué)的分析能力與CARD-FISH的空間分辨率，巧妙地將固氮和甲烷氧化與居住在水稻根維管束和表皮細胞中的甲基孢霉科細菌聯(lián)系在一起[20]。
永凍土是一種獨特的棲息地，擁有驚人的多樣性的嗜冷微生物[21]，是最近一項綜合宏基因組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)和宏蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的綜合性研究的對象。這項研究確定了凍土層微生物群中可能高表達的蛋白質(zhì)，例如冷休克蛋白，以及更令人驚訝的功能，包括與生物運動性相關(guān)的蛋白質(zhì)。然而，這種環(huán)境的獨特性可能限制了通常的蛋白質(zhì)組學(xué)范式，即蛋白質(zhì)的存在表明其活性。因此，這種研究將受益于就地穩(wěn)定同位素標記方法，這將允許隨后確定標記的蛋白質(zhì)及其與具有實際活動的群落成員的聯(lián)系。

3.3 活性污泥

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活性污泥是工業(yè)化世界中最常見的廢水處理形式，優(yōu)化該過程需要對這些相對復(fù)雜的微生物生態(tài)系統(tǒng)有更好的了解。宏蛋白質(zhì)組學(xué)起源于活性污泥研究，最初的研究是在實驗室規(guī)模的系統(tǒng)上進行的-進行強化生物除磷(EBPR) [22, 23]。這些研究依賴于2D-PAGE蛋白分離，并通過LC-MS/MS和de novo肽測序?qū)η谐牡鞍走M行鑒定。隨著這些生態(tài)系統(tǒng)的宏基因組的出現(xiàn)，隨后對EBPR的宏蛋白質(zhì)組學(xué)研究更加深入，并且通過使用nano-LC進行肽分離，分析變得更加自動化。通過對涉及EBPR的優(yōu)勢菌的研究，揭示了與性能相關(guān)的關(guān)鍵功能。此外，酶變異的檢測表明，一定程度的遺傳多樣性對EBPR的穩(wěn)定性能很重要。這些研究還表明，在EBPR 中，在快速交替的厭氧階段和有氧階段之間，僅檢測到微小的差異。因此，放射性標記的35S‐蛋氨酸僅用于檢測EBPR期內(nèi)新合成的蛋白。研究結(jié)果表明，乙醛酸循環(huán)在有氧階段是重要的，這與之前對EBPR代謝的推測相反。在另一項研究中，可以檢測到活性污泥蛋白質(zhì)組的快速變化(在15分鐘內(nèi))，這是對之前未見過的環(huán)境刺激物Cd暴露的反應(yīng)。此外，在活性污泥中檢測了宏蛋白質(zhì)組學(xué)的靈敏度，當濃度約為千分之一的生物量時，可以檢測到添加菌株的蛋白質(zhì)。最后，對系統(tǒng)中不可或缺的胞外聚合物的宏蛋白質(zhì)組進行了詳細研究，揭示了一些可能在活性污泥生物量中發(fā)揮不同作用的細胞質(zhì)蛋白[24, 25]。

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