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在對(duì)蛋白的研究中，結(jié)構(gòu)生物學(xué)是一個(gè)重要的范疇。其闡釋生物大分子的三維結(jié)構(gòu)。在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中，冷凍電鏡是絕對(duì)主力。而由于冷凍電鏡與晶體學(xué)方法無法看清楚蛋白質(zhì)的柔性區(qū)域的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致無法對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)合體進(jìn)行建模。這些問題促進(jìn)了質(zhì)譜技術(shù)作為表征手段為結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展提供幫助。
交聯(lián)質(zhì)譜法(Chemical cross-linking of proteins coupled with mass spectrometry analysis ,CXMS)是指利用化學(xué)交聯(lián)劑將蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合體中空間距離足夠接近的兩個(gè)氨基酸通過共價(jià)鍵連接起來，酶切成肽段后用質(zhì)譜鑒定出交聯(lián)位點(diǎn)，從而獲取低分辨度結(jié)構(gòu)信息，幫助推斷蛋白質(zhì)在三維空間的折疊狀態(tài)以及蛋白-蛋白相互作用的大致區(qū)域。
化學(xué)交聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)是近年來發(fā)展起來的新方法，其利用化學(xué)交聯(lián)劑處理蛋白質(zhì)樣品，將空間距離足夠接近、可以與交聯(lián)劑反應(yīng)的兩個(gè)氨基酸以共價(jià)鍵連接起來，然后利用基于質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)手段分析交聯(lián)產(chǎn)物。這項(xiàng)技術(shù)有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如在于可以高通量地進(jìn)行多種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和相互作用分析，比傳統(tǒng)方法速度快、信息產(chǎn)出規(guī)模大；通過交聯(lián)劑的共價(jià)交聯(lián)作用，可以固定原本不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)相互作用，從而可以研究一大類容易解離的、結(jié)構(gòu)松散的蛋白質(zhì)復(fù)合物；相對(duì)于核磁共振、X 射線晶體衍射，交聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)靈敏度高、對(duì)蛋白質(zhì)性狀要求低、需要樣品絕對(duì)量小；可以進(jìn)行體內(nèi)交聯(lián)，有助于研究體內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和相互作用；由于交聯(lián)后的蛋白質(zhì)先經(jīng)過酶切之后才進(jìn)行質(zhì)譜分析，所以不受蛋白質(zhì)本身的長度影響；使用不同臂長、不同反應(yīng)基團(tuán)的交聯(lián)劑可以得到更多的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)和相互作用信息。
Fig.1CXMS 技術(shù)流程圖
CXMS技術(shù)是一項(xiàng)有挑戰(zhàn)性的技術(shù)。其技術(shù)難點(diǎn)在于實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析兩部分。實(shí)驗(yàn)部分的難點(diǎn)在于交聯(lián)與質(zhì)譜鑒定。最常用的交聯(lián)劑是氨基反應(yīng)的琥珀酰亞胺酯類，它們主要與K上的側(cè)鏈氨基或蛋白的N端氨基進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)。其次還有一些特色交聯(lián)劑，如含有親和基團(tuán)的交聯(lián)劑、在二級(jí)譜圖中產(chǎn)生特殊碎裂信號(hào)的交聯(lián)劑及同位素交聯(lián)劑等。而由于交聯(lián)后的多肽豐度低、交聯(lián)形式復(fù)雜等問題，質(zhì)譜鑒定也存在困難。我司基于nature methods文獻(xiàn)[1]及配合pLink軟件，對(duì)所鑒定的復(fù)雜的cross-linked譜圖通過嚴(yán)格的FDR策略進(jìn)行判別，以得到可信的蛋白cross-linked結(jié)果。
Fig.2 CXMS結(jié)果-譜圖示例
